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高效液相色谱柱的使用方法技巧

发布时间:2019-05-17 09:49:12 作者:

  色谱柱的使用和维护:液相色谱仪由高压液压泵、检测器和液相色谱柱组成,其中正确安装和使用液相色谱柱是液相色谱工作的关键。这也是液相色谱工作者获得正确可靠的实验数据的必由之路。

为什么要学习使用高效液相色谱柱?

色谱柱的使用与维护:液相色谱仪由高压液泵、检测器和液相色谱柱组成。液相色谱柱的正确安装和使用是液相色谱工作的关键。这也是液相色谱仪获得正确可靠的实验数据,建立高效液相色谱仪日常维护保养规程,确保正常使用的必由之路。

高效液相色谱柱的适用范围:

该方法适用于高效液相色谱柱的维护和维护。

 

1.液相色谱柱结构:

主要研究结果如下:(1)液相色谱柱由柱管、压力帽、夹套(密封环)、筛板(过滤器)、接头、螺钉(头)和柱填料组成。

柱管:不锈钢制成,如果柱压不超过70 kg/cm2,也可使用厚壁玻璃或石英管,内壁要求较高的光洁度。用于柱包装。空塔的所有部件都是不锈钢制成的,能够承受一般溶剂的作用。但由于含氯化物的溶剂对其有一定的腐蚀性,故使用时要注意,柱及连接管内不能长时间存留此类溶剂,以避免腐蚀。压力帽:一种塑料圆柱形盖,其两端包裹在柱端的外墙上,中间有小孔,主要由聚四氟乙烯制成,用于固定筛板。

密封圈:位于连接螺旋环内壁的弹性环,主要由聚四氟乙烯制成,用来密封色谱柱两端的盖子和色谱柱的外壁。

(2)柱填料:

液相色谱柱在填料和流动相之间进行分离,并根据填料的类型对色谱柱进行分类。

正相柱:

它们大多以硅胶作为柱填料。按形貌可分为无定形和球形,粒径在3≤10μm范围内。另一种正相填料是硅胶表面键合-CN、-NH2等官能团,即键合相硅胶。

反相柱:

将非极性填料十八烷基官能团(ODS)键合在硅胶表面。也存在无定形和球形的差异。

其它常用的反相填料有键合C8、C4、C2、苯基等,粒径在3-10um之间。

2.色谱柱的安装:

(1)拆下柱填料盒,并确认储存在柱中的类型、大小、出厂日期和溶剂。

(2)拧开柱两端接头的密封塞,并将其放回包装盒内以作备份。

(3)根据柱管上指示的流动相流向,柱的入口端通过连接管与注入阀的出口相连(如条件允许,建议在柱前设置保护柱);柱的出口与检测器相连。连接管为外径1.57 mm、内径0.1~0.3 mm的不锈钢管。连接管两端有空心螺钉和密封环。在接管时一定要设法降低柱外死体积。连接管通过空心螺钉、压环后尽量用力插到底,然后顺时针拧紧空心螺钉,直到拧不动为止。

液相色谱柱的使用

在使用该列之前,好先测试该列的性能,并将结果保存起来,以供将来评估该列的性能时参考。但是,需要注意的是,由于样品、流动相、柱温等因素的不同,柱的性能可能会有所不同。此外,柱性能试验是根据柱工厂报告中的条件(工厂试验中使用的条件)进行的,只有这样,才能使测量结果具有可比性。

1.样品的前处理:

(1)用流动相溶解样品效果好;

(2)用处理柱去除样品中的强极性或用柱填料产生不可逆吸附杂质;

(3)采用0.45μm滤膜去除颗粒杂质;

2.流动相的配制:

液相色谱是通过柱填料和流动相之间的质量交换对样品组分进行分离的过程。因此,流动相必须具有以下特性:

主要结果如下:(1)流动相对于样品具有一定的溶解度,保证了样品组分不会在柱内沉淀(或长时间保留在柱中)。

(2)流动相具有一定的惯性,不与样品发生化学反应(特殊情况除外)。

(3)分析柱越长,流动相的粘度越小,分离效果越好,同时降低柱的压降,延长液泵的使用寿命(采用升温的方法可以降低流动相的粘度)。

(4)流动相的物理化学性质应适合于使用的检测器,如使用紫外检测器,好采用低紫外吸收的溶剂。

(5)流动相沸点不宜过低,否则易产生气泡,不能进行实验。

(6)准备好流动相后,必须进行除气。除去溶解在流动相中的微量气体不仅有利于检测,而且还可以防止流动相和样品中痕量氧之间的相互作用。

 

3. 流速的选择:

由于柱效应是柱内流动相线性流速的函数,不同流速下可获得不同的柱效应。对于特定的柱,为了追求的柱效果,好采用流速。对于内径为4.6mm的柱,流速为1mL/min;内径为4.0mm的柱,流速为0.8mL/min。当选择速度时,可延长分析时间。改变流动相洗涤强度的方法可缩短分析时间(如采用反相柱可适当增加甲醇或乙腈的含量)。

4. 流动相使用注意事项:

主要结果如下:(1)由于甲醇价格低廉,推荐采用甲醇反相柱(乙腈除外)。

(2)正相柱以30℃~60℃的石油醚为流动相,正己烷为流动相;未经净化的正己烷不能使用。好使用超纯水(电阻率大于18兆欧)。去离子水和二次蒸馏水中含有酚类杂质,这可能会影响分析结果。

(3)以缓冲溶液为流动相,在实验前制备出流动相,特别是在夏季。好是添加叠氮化钠,以防止细菌的生长。

(4)流动相要求使用0.45μm滤膜去除颗粒杂质。

(5)采用高效液相色谱法制备流动相,采用合适的流动相,可以延长色谱柱的使用寿命,提高色谱柱的性能。

液相色谱柱的保存

1.反向色谱柱实验后的保养:

用含盐缓冲液或流动相后,用10%甲醇/水冲洗30分钟,洗去色谱柱中的盐,再用甲醇冲洗30分钟。注意:不要用纯水冲洗塔,应在水中加入10%的甲醇,以防止填料倒塌。

2.长期保存色谱柱:

例如,色谱柱若要长期保存,必须保存在合适的溶剂中,反相柱可以储存在纯甲醇或乙腈中,正相柱可以储存在严格脱水的纯正己烷中。离子交换柱可以储存在水中(含防腐剂、叠氮化钠或硫柳汞),并在室温下堵塞插头。

液相色谱柱的再生

因为,色谱柱是消耗品,随着使用时间或进样次数的增加,会出现色谱峰高降低,峰宽加大或出现肩峰的现象,一般来说是柱效的下降。

1.反向柱的再生:

色谱柱以甲醇:水=10:90(V/V)为流动相,乙腈-异丙醇为流动相,色谱柱体积为甲醇:水=10:90(V/V)的20~30倍,流动相为乙腈-异丙醇。

2.正相柱的再生:

柱容为20×30倍,异丙醇(异丙醇粘度高,可降低流速,避免压力过大),二氯甲烷、甲醇为流动相冲洗柱,然后按反序冲洗。请注意,上述溶剂必须严格脱水。

3.离子交换柱的再生:

在缓冲溶液中长期使用和进样会导致色谱柱离子交换容量的下降。阳离子柱可以通过用稀酸缓冲液洗涤来再生,并且可以通过用稀碱缓冲液洗涤来再生阴离子柱。

特别说明:

再生过程中必须随时注意塔内压力的变化。过高的柱压容易导致硅胶的变形和开裂,导致键合相极性端键合顺序的紊乱。同时,必须确保再生时间充足。再生时,好选择无在线脱气的独立抽气系统色谱仪,以防止常相溶剂损坏汽提塔密封膜或仪器精密部件如分子筛、比例阀等。

液相色谱柱常见问题分析与解决方案

1.使用一段时间后柱压过高:

解决办法:首先,检查HPLC系统的原因是否合理,排除系统原因后,主要原因是实验过程中柱中杂质的积累。为了尽可能改善操作条件,样品应及时清洗,如缓冲盐流动相必须用较高比例的水溶液(如90%)清洗,然后用有机相保存。

2.筛板堵塞与柱头塌陷:

解决方案:如果确定色谱柱的滤板受到污染,则可用甲醇向相反方向清洗色谱柱至常压,或将色谱柱除去,并小心地除去筛板。超声处理用约5%硝酸溶液处理约20分钟,然后用纯水超声处理约20分钟,然后重新装入色谱柱。

3.色谱柱填料受样品污染:

解决方法:

如果确定色谱柱填料受到污染,则取下色谱柱螺钉,挖出色谱柱前部受污染的填料,再用相同的色谱柱填料填充。仔细修理后,重新安装上柱螺钉。

4。色谱柱中的缓冲液中的盐遇到高浓度的甲醇或其他有机溶剂,从而导致结晶和沉淀:

解决方法:

若确定为盐结晶,用10%甲醇/水冲洗柱,溶解全部盐,然后改变高浓度甲醇。

注意事项:

1。在任何时候,都要保证色谱柱床不会干涸,特别是在进样检测和柱清洗过程中,流动相不能长时间倒空(30min以上),否则很容易使色谱柱干涸,产生大量难以排出的气泡。甚至导致柱床中部局部坍塌或开裂。

2。使用和保存时,严禁用力抛掷,绝对杜绝粗心猛烈撞击或从高处摔下,否则极易对柱床造成机械损伤,无再生的可能。

3。当柱和色谱仪连接时,必须清洗阀门部分或管道;

4。避免使用高粘度溶剂作为流动相;

5.进样样品要全溶解;

6.大多数反相色谱柱的pH稳定范围是2~7.5,尽量不超过该色谱柱的pH范围;

7。在日常分析工作结束时,清洗注入阀中剩余的样品;

8。在每天的分析和测定结束时,应使用适当的溶剂对色谱柱进行清洗。

9。如果分析柱长时间不使用,则应用适当的有机溶剂进行保存和密封。