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液相色谱仪分离纯化烟草疫霉菌激发子

发布时间:2019-06-11 16:39:46 作者:

 

采用阴离子交换层析和疏水相互作用层析从烟草疫霉菌培养基中分离出一种新的90和激发蛋白,讨论了阴离子交换色谱流动相的最佳值,建立了疏水作用色谱、硫酸铵和羟甲基氨基甲酸酯的水洗脱方式,简化了纯化步骤,降低了活性损失的风险。

1。引言1988等1。首次从疫霉病菌培养基中分离出分子量为种子印记的蛋白质,命名为诱导子。由于该菌对棉花类寄主植物能造成毁灭性病害,因此对疫霉菌激发子霉病等多种重要植物病原物的系统广谱抗性,诱导植株产生广谱抗病性,使得它具备了作为新型生物农药的条件,所以植物病理学家直在努力分离提取和研究激发子蛋白2本文从烟草疫霉菌,此0〃31.在新00,0培养基中,采用阴离子交换色谱法和准多维色谱法分离纯化了一种新的90乳诱导子,国内外尚无报道。了解植物抗疫霉病的分子机理,设计植物抗疫霉病基因工程,开发新的生物农药,具有重要的理论和实践价值。

2.1试剂和仪器,蛋白快速高效液相色谱仪,试剂566是阴离子交换色谱填料;366类;纸疏水色谱填料;例如,3、咖啡6、预填充柱、81 S公司;轻甲基脲,3、0-Out公司。

2.2提取粗蛋白4,离心2,加入硫酸铵至7,4,静置过夜。12离心5芯沉淀,2,0,3。

6.0暂停。悬浮液在10000和3环己烷后离心分离。

2.3色谱仪条件2.3.1阴离子交换柱3邦150216。;流动相入。20儿6.0,8.Man+1后1二氯化钠;流速2.5、30,梯度洗脱介质虚线。

用疏水层析法提取活性峰组分,进行进一步纯化。

2.3.2疏水作用色谱柱56,8扭书6阻。;流动相人。0.8mL硫酸铵20mmoyLTis.HClpH6.0;B.MiniQ水;流速l,5myL.梯度洗脱中虚线所,2.4活性和纯度测定将1001激发子呀3溶液注入盆栽烟草叶片,24之后即可看到坏死性斑点。用十碳酰钠横向电泳505测定蛋白质纯度。

3结果和讨论3.1阴离子交换色谱1的选择蛋白质的阴离子交换色谱,流动相的,1值是十分重要的参数,经过比较选择流动相的口1定为,16013.当,为70,时,杂质峰2干扰活性峰对后面进步的纯化带来了困难;当流动相的PH为5,0lC时,活性峰的得率仅为流动相pH6.0时的50.

3.2疏水色谱填料的选择3疏水色谱填料包括两种新型填料:基于聚苯乙烯和琼脂糖的源系列86、3、6系列其他填料。然而,配体是苯基epharose phehp和资源13。预包装的短柱填料显示出完全不同的色谱特性,从21可以看出。当激子峰1不能与杂质分离时,可能是激子蛋白不仅与配体相互作用,而且在穿过疏水柱时参与色谱仪过程。

3.3疏水色谱条件的选择本实验的高效液相色谱仪过程主要包括色谱过程、液相色谱过程和反相色谱过程。在“497”液相色谱法分离纯化烟草疫霉激子的过程开始时,流动相为203加0.8,1亚硫酸氢铵,以促进目标蛋白与填料之间的疏水作用。这是一个疏水相互作用的色谱过程。然后用纯水860,38,nbsp洗脱目标蛋白,它是一种以苯基为种子配体的填充物,非极性,流动相为强极性水,因此第一相实际上是反相色谱过程。为了最大限度地分离目标蛋白和杂质蛋白,采用逐步改变流动相的方法,用0.4硫酸铵洗脱杂质蛋白。

3.4在色谱过程的每一步鉴定激子的纯度和活性,将目的蛋白稀释到分级水平,并给烟叶注射器。24岁后可见坏死斑。

用308电泳法测定纯度。纯化后的目标蛋白与标准分子量蛋白均电泳。在97.4kd标准蛋白附近可见一条清晰的蛋白带。